Клонирование кднк гена поли(АДФ-рибоза) полимеразы 2 Arabidopsis thaliana в Saccharomyces cerevisiae
DOI:
https://doi.org/10.26577/eb.2020.v84.i3.08Аннотация
Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) катализирует синтез полимеров АДФ-рибозы ковалентно-прикрепленные к акцепторным белкам. При этом донором остатков АДФ-рибозы выступает НАД+. Одной из наиболее известных ролей PARP является их функция в качестве сенсора повреждения ДНК. PARP1, в частности, связывается в поли(АДФ-рибозил)ированной форме с разрывами ДНК и привлекает белковую машину репарации ДНК в места повреждения ДНК. Недавно, впервые показано, что PARP поли-АДФ-рибозилирует не только белки, но и концы разрывов ДНК. Однако, в настоящее время нет прямых доказательств наличия поли-АДФ-рибозилированных ДНК-аддуктов в условиях in vivo как в животных, так и в растениях.
В клетках Saccharomyces cerevisiae отсутствует PARP активность, несмотря на то, что он обнаружен в организмах от архебактерий до млекопитающих. Из-за простоты манипулирования и генетической трактуемости дрожжи S. cerevisiae были использованы для анализа функции многих белков из клеток животных и растений. В связи с этим целью нашей работы является клонирование и гетерологичная экспрессия гена AtPARP2 из модельного растения Arabidopsis thaliana в дрожжах.
С применением генно-инженерных методов нами сконструирована рекомбинантная плазмида с кДНК геном AtPARP2 под контролем индуцибельного промотора GAL10 эписомального вектора pESC-LEU2. Методом генетической трансформации получен рекомбинантный штам S. cerevisiae, способный экспрессировать кДНК ген АtPARP2. Методом Вестерн-блоттинга с применением полученных нами поликлональных анти-АtPARP2 антител выявлено, что продуктом экспрессии гена в дрожжах является глобулярный белок массой 72 кДа, состоящий из 637 аминокислот (pI 5,92). Показано незначительное ингибирование роста в дрожжевых клетках FF 18733, экспрессирующих АtPARP2. Индукция экспрессии AtPARP2 в дрожжевых клетках, выявило PARилирующию активность белка in vivo. Показано авто-поли(АДФ-рибозил)ирующая активность AtPARP2 в дрожжах в ответ на двухцепочечные разрывы ДНК, индуцированные обработкой клеток блеомицином. Ингибитор PARP фермента 3-АВ значительно ингибировал количество поли АДФ-рибозилированных белковых продуктов.
Ключевые слова: Поли(АДФ-рибоза) полимераза, AtPARP2, поли-АДФ-рибозилирование, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisae.
Библиографиялық сілтемелер
2 Ame´ J-C., Spenlehauer C., de Murcia G. The PARP superfamily // BioEssays. – 2004. – Vol. 26. – P. 882-893.
3 Schreiber V., Dantzer F., Ame J-C., de Murcia G. Poly(ADP -ribose): novel functions for an old molecule // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2006. – Vol. 7. – P. 517-528.
4 Woodhouse B.C., Dianov G.L. Poly ADP -ribose polymerase-1: an international molecule of mystery // DNA Repair. – 2008. – Vol. 7. – P. 1077-1086.
5 Briggs A.G, Bent A.F. Poly(ADP -ribosyl)ation in plants // Trends Plant Sci. – 2011. – Vol. 16, № 7. – P. 372-80.
6 Lamb R.S., Citarelli M., Teotia S. Functions of the poly(ADP -ribose) polymerase superfamily in plants // Cell Mol. Life Sci. – 2012. – Vol. 69, № 2. – P.175-89.
7 Briggs A.G., Bent A.F. Poly(ADP -ribosyl)ation in plants // Trends in Plant Science. – 2011. – Vol. 16, № 7. – P. 360-1385.
8 Hinz J.M., Rodriguez Y., Smerdon M.J. Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2010. – Vol. 107. – P. 4646-4651.
9 Odell I.D., Barbour J.E., Murphy D.L., Della-Maria J.A., Sweasy J.B., Tomkinson A.E., Wallace, S.S., Pederson, D.S. Nucleosome disruption by DNA ligase III-XRCC1 promotes efficient base excision repair // Mol. Cell. Biol. – 2011. – Vol. 31. – P. 4623-4632.
10 Bonicalzi M.E., Haince J.F., Droit A., Poirier G.G. Regulation of poly(ADP-ribose) metabolism by poly(endonuclease of bull seminal plasma induced by ADP-ribosylation -ribose) glycohydrolase: where and when? // Cell. Mol. Life Sci. – 2005. – Vol. 62. – P. 739-750.
11 Ono T., Kasamatsu A., Oka S., Moss J. The 39-kDa poly-(ADP-ribose) glycohydrolase ARH3 hydrolyzes O-acetyl-ADP -ribose, a product of the Sir2 family of acetyl-histone deacetylases // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2006. – Vol. 103. – P. 16687-16691.
12 Sharifi R., Morra R., Appel C.D., Tallis M. et al. Deficiency of terminal endonuclease of bull seminal plasma induced by ADP-ribosylation -ribose protein glycohydrolase TARG1/C6orf130 in neurodegenerative disease // EMBO J. – 2013. – Vol. 32. – P.1225-1237.
13 Koh D.W., Lawler A.M., Poitras M.F., Sasaki M., Wattler S., Nehls M.C., Stoger T., Poirier G.G., Dawson V.L., Dawson T.M. Failure to degrade poly(ADP-ribose) causes increased sensitivity to cytotoxicity and early embryonic lethality // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2004. – Vol. 101. – P. 17699-17704.
14 Ame J.C., Fouquerel E., Gauthier L.R., Biard,D., Boussin F.D., Dantzer F., de Murcia G., Schreiber V. Radiation-induced mitotic catastrophe in PARG-deficient cells // J. Cell Sci. 2009. – Vol. 122. – P. 1990-2002.
15 Suter B., Auerbach D., Stagljar I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond // Biotechniques. – 2006. – Vol. 40. – P. 625–644.
16 Hartwell L.H. Yeast and cancer // Biosci. Rep. – 2004. – Vol. 24. – P. 523–544.
17 Rissel D., Heym P.P., Peiter E.A. yeast growth assay to characterize plant poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) proteins and inhibitors // Anal. Biochem. – 2017. – Vol. 15, №527. – P. 20-23.
18 Kuanbay A.K., Smekenov I.T., Saparbayev M.K., Ishchenko А.А., Taipakova S.M., Bissenbaev A.K. Isolation and characterization of Arabidopsis thaliana poly(ADP-ribose) polymerase 2 cDNA// Experimental Biology. -2018. -Vol. 74, №1. - P. 99-111.
19 Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227. - № 5259. – P. 680-685.
20 Kaiser P., Auer B., Schweiger M. Inhibition of cell proliferation in Saccharomyces cerevisiae by expression of human NADþ ADP-ribosyltransferase requires the DNA-binding domain (“zinc fingers”) // Mol. Gen. Genet. – 1992. – Vol. 232. – P. 231e239.
21 Perrin D., Gras S., van Hille B., Hill B.T. Expression in yeast and purification of functional recombinant human poly(ADP-ribose)polymerase (PARP). Comparative pharmacological profile with that of the rat enzyme // J. Enzyme Inhib. – 2000. – Vol. 15. – P. 461e469.
22 Perkins E., Sun D., Nguyen A., Tulac S., Francesco M., Tavana H., Nguyen H., Tugendreich S., Barthmaier P., Couto J., Yeh E., Thode S., Jarnagin K., Jain A., Morgans D., Melese T. Novel inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase PARP1 and PARP2 identified using a cell-based screen in yeast // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 4175e4183.
23 Tao Z., Gao P., Liu H.W. Studies of the expression of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 in Saccharomyces cerevisiae and identification of PARP-1 substrates by yeast proteome microarray screening // Biochemistry. – 2009. – Vol. 48. – P. 11745e11754.
24 La Ferla M., Mercatanti A., Rocchi G., Lodovichi S., Cervelli T., Pignata L., Caligo M.A., Galli A. Expression of human poly (ADP-ribose) polymerase 1 in Saccharomyces cerevisiae: effect on survival, homologous recombination and identification of genes involved in intracellular localization // Mut. Res. - Fundam. Mol. Mechan. Mutagen. – 2015. – Vol. 774. – P. 14e24.
25 Rissel D., Heym P.P., Thor K., Brandt W., Wessjohann L.A., Peiter E. No silver bullet - canonical poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are no universal factors of abiotic and biotic stress resistance of Arabidopsis thaliana // Front. Plant Sci. 2007. – Vol. 8. – P. 59.
26 Gottipati P., Vischioni B., Schultz N., Solomons J., Bryant H.E., Djureinovic T., Issaeva N., Sleeth K., Sharma R.A., Helleday T. Poly(ADP-ribose) polymerase is hyperactivated in homologous recombination-defective cells // Cancer Res. – 2010. – Vol. 70. – P. 5389–5398.
27 Weil M.K., Chen A.P. PARP inhibitor treatment in ovarian and breast cancer // Curr. Probl. Cancer. – 2011. – Vol. 35. – P. 7–50.
28 De Vos M., Schreiber V., Dantzer F. The diverse roles and clinical relevance of PARPs in DNA damage repair: current state of the art // Biochem. Pharmacol. – 2012. – Vol. 84. – P. 137–146.
29 Tao G.H., Yang L.Q., Gong C.M., Huang H.Y., Liu J.D., Liu J.J., Yuan J.H., Chen W., Zhuang Z.X. Effect of PARP-1 deficiency on DNA damage and repair in human bronchial epithelial cells exposed to benzo(a)pyrene // Mol. Biol. Rep. – 2009. – Vol. 36. – P. 2413–2422.
30 De Block M., Verduyn C., De Brouwer D., Cornelissen M. Poly(ADP-ribose) polymerase in plants affects energy homeostasis, cell death and stress tolerance // Plant J. - 2005. - Vol. 41. – P. 95–106.
31 Amy G. Briggs and Andrew F. Bent. Poly(ADP-ribosyl)ation in plants // Trends in Plant Science. - 2011. - Vol. 16, № 7. - P. 360-1385.
32 Abraham A.T., Lin J., Newton D.L., Rybak S., Hecht S. RNA cleavage and inhibition of protein synthesis by bleomycin // Chem. Biol. – 2003. – Vol. 10. – P. 45–52.
33 Povirk L.F., Han Y.H., Steighner R.J. Structure of bleomycin-induced DNA double-strand breaks: predominance of blunt ends and single-base 5' extensions // Biochemistry. – 1989. – Vol. 28, № 14. – P. 5808-14.
