Физико-химические свойства бактериальной целлюлозы, полученной новым штаммом Komagataeibacter xylinus C-3 на оптимизированной питательной среде
Ключевые слова:
бактериальная целлюлоза, гель-пленка, Komagataeibacter xylinusАннотация
Бактериальная целлюлоза (БЦ) – природный полимер, характеризующийся высокой адсорбционной способностью, биологической совместимостью и механической прочностью. В отличие от растительной целлюлозы, БЦ химически чистый внеклеточный продукт. Благодаря своим уникальным свойствам БЦ является перспективным материалом для медицины.
Исследования по разработке и применению БЦ в области медицинского материаловедения проводятся во многих странах. Однако в Казахстане до сих пор не налажено производство БЦ, а в коллекциях отсутствуют штаммы-продуценты для ее получения в производственных масштабах.
Для этого было предпринято настоящее исследование, цель которого – выделить штамм продуцент бактериальной целлюлозы и подобрать оптимальные условия для его роста и биосинтеза гель-пленки БЦ в поверхностных условиях культивирования.
Штаммы-продуценты бактериальной целлюлозы выделяли из смешанной культуры чайного кваса, а также яблочного уксуса фирмы «Эль-иксир» на среде S. Hestrin, M. Shramm. Факторами оптимизации питательной среды служили верхний и нижний уровни концентрации глюкозы, пивного сусла и этанола. Продуктивность штаммов оценивали путем измерения массы БЦ, которую предварительно высушивали при 80°С. Культурально–морфологические свойства выделенного штамма изучали с помощью лабораторного микроскопа «БИОЛАМ». Для биохимической идентификации штаммов применяли баканализатор Vitek c стандартизированные тест-системы API 50 CH и API 20 E с программным обеспечением идентификации Аpiweb производства ВioMerieux (Франция). Видовая принадлежность штамма и чистота на контаминацию посторонней микрофлорой определена путем анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Исследование структуры пленок проводили на растровом электронном микроскопе. Механическую прочность БЦ определяли на разрывной машине «Instron».
Выделен, идентифицирован и генотипирован новый продуцент бактериальной целлюлозы Komagataeibacter xylinus С-3. Определены параметры роста и продуктивности двух коллекционных (Gluconoacetobacter xylinus В-11240 и G. hansenii В-6756) и нового штамма Komagataeibacter xylinus С-3 на средах, содержащих разные источники углерода и питательные добавки в условиях статического культивирования. Подобраны условия поверхностного культивирования штамма, обеспечивающие максимальный уровень биосинтеза БЦ, разработан способ очистки пленки. Оптимальной питательной средой для образования гель-пленки БЦ штаммом Komagataeibacter xylinus С-3 в статических условиях культивирования является среда НS c 1% глюкозой, 0,5% этанолом и добавлением пивного сусла в количестве 0,1%. Максимальный выход БЦ - 7,11 г/л достигался при культивировании продуцента в течение 5 дней при 300С. Новый штамм по уровню продуктивности превосходит коллекционные штаммы G. xylinus В-11240 и G. hansenii В-6756, рекомендованные для промышленного получения целлюлозы. Штамм размещен в Gen Bank под номером KU598766.
Электронно-микроскопическое исследование структурных особенностей полученной гель-пленки показало, что она состоит из микрофибриллярных лент наноуровневых размеров (15-55 нм). Пористая структура гель-пленки и высокая степень кристалличности обеспечивает ей отличную механическую прочность (17,01+0,5 МПа). Пленка характеризуется высокой сорбционной мощностью, позволяющей удерживать 11 г воды на 1 г дегидратированного полимера.
Бактериальная целлюлоза, синтезируемая штаммом Komagateibacter xylinus C-3 в условиях поверхностного культивирования, может быть основой для получения сверхпрочных нанокомпозиционных материалов в биомедицинских и других смежных областях.
Библиографические ссылки
2. Backdahl H., Helenius G., Bodin A., Nannmark U., Johansson B. R., Risberg B., Gatenholm P. Mechanical properties of bacterial cellulose and interaction swith smooth muscle cells // Biomaterials, 27. – 2006. – Р. 2141-2149.
3. Bae S., Shoda M. Bacterial cellulose production by fed-batch fermentation in molasses medium // Biotechnology Progress, 20. – 2004. – Р. 1366–1371.
4. Bodin A., Backdahl H., Fink H., Gustafsson L., Risberg B., Gatenholm P. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes // Biotechnol Bioeng, 97. – 2007. – Р. 425–434.
5. Cai Z., Kim J. Bacterial cellulose/poly (ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility // Cellulose, 17. – 2010. – Р. 83-91.
6. Chawla P.R., Bajaj I.B., Survase A.S., Singhal R.S. Microbial cellulose: fermentative production and application // Food Technol Biotechnol, 47. – 2009. – Р. 107–124.
7. Clarridge III J. E. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases // Clinical Microbiology Reviews, 17. – 2004. – Р. 840–862.
8. Clayton R. A., Sutton G., Hinkle P. S., Bult Jr. C., Fields C. Intraspecific variation in small-subunit rRNA sequences in GenBank: why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa // International Journal of Systematic Bacteriology, 45. – 1995. – Р. 595–599.
9. Czaja W., Krystynowicz A., Bielecki S., Brown R. J. Microbial cellulose — the natural power to heal wounds // Biomaterials, 27. – 2006. – Р. 145-151.
10. Czaja W., Romanovicz D., Brown R. M. Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture // Cellulose, 11. – 2004. – P. 403-411.
11. Czaja, W.K., Young, D.J., Kawecki M., Brown R.M. The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications // Biomacromolecules, 8. – 2007. – P. 1-12.
12. Dahman Y., Nanostructured biomaterials and biocomposites from bacterial cellulose nanofibers // Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 9. – 2009. – P. 5105–5122.
13. Guzun A.S., Stroescu M., Jinga S.I., Voicu G., Grumezescu A.M., Holban A.M. Plackett-Burman experimental design for bacterial cellulose-silica composites synthesis // Mater Sci Eng C Mater Biol Appl., 42. – 2014. – P. 280.
14. Jeong S.I., Lee S.E., Yang H., Jin Y.H., Park C.S., Park Y.S. Toxicologic evaluation of bacterial synthesized cellulose in endothelial cells and animals // Molecular & Cellular Toxicology, 6. – 2010. – P. 373-380.
15. Klemm D., Heublein B., Fink H.P., Bohn A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material // J Angew Chem Int Ed, 44. – 2005. – P. 3358-3393.
16. Laçin N.T. Development of biodegradable antibacterial cellulose based hydrogel membranes for wound healing // Int J Biol Macromol., 67. – 2014. – P. 22-27.
17. Lin W.C., Lien C.C., Yeh H.J., Yu C.M., Hsu S.H. Bacterial cellulose and bacterial cellulose-chitosan membranes for wound dressing applications // Carbohydr Polym, 94. – 2013. – P. 603-611.
18. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I. S. Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66. – 2002. – P. 506.
19. Mikkelsen D., Flanagan B.M., Dykes G.A., Gidley M.J. Influence of different carbon sources on bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus strain ATCC 53524 // J Appl Microbiol, 107. – 2009. – P. 576–583.
20. Miller, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar / G.L. Miller // Anal. Chem. – 1959. – Vol. 31. – P. 426–429.
21. Naritomi T., Kouda T., Yano H., Yoshinaga F. Effect of ethanol on bacterial cellulose production from fructose in continuous culture // J Ferment Bioeng, 85. – 1998. – P. 598–603.
22. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Колотилова Н.Н. и др. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов высших учебных заведений. (ред. Нетрусов А.И.). – М.: Академия. – 2005. – С. 608.
23. Nge T. T., Nogi M., Yano H., Sugiyama J. Microstructure and mechanical properties of bacterial cellulose/chitosan porous scaffold // Cellulose, 17. – 2010. – P. 349-363.
24. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др. – М.: Мир, 1997. – Т 1. – С. 800 .
25. Pértile R. A, Moreira S., Costa R.M., Correia A., Guardão L., Gartner F., Vilanova M., Gama M. Bacterial Cellulose: Long-Term Biocompatibility Studies // J Biomater Sci Polym Ed, 23. – 2011. – P. 231-236.
26. Ramana K.V., Tomar A., Singh L. Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum // World J Microbiol Biotechnol, 16. – 2000. – P. 245–248.
27. Romanov D.P., Baklagina Yu.G., Lukasheva N.V., Khripunov A.K., Kachenko A.A., Lavrentyev V.K., Klechkovskaya V.V., Arkharova N.A., Tolmachev D.A. Investigation of Nanocomposites Based on Hydrated Calcium Phosphates and Cellulose Acetobacter xylinum // Journal Glass Physics and Chemistry, 34. – 2008. – P. 192–200.
28. Ross P., Mayer R., and Benziman M. Cellulose biosynthesis and function in bacteria // Microbiol Mol Biol Rev. – 1991. – vol. 55, no. 1, P. 35-58.
29. Ruka R.D., Simon P.G., Dean K., Altering the growth conditions of Gluconoacetobacter xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose // CSIRO Materials Science and Engineering. – 2015. – P. 1-21.
30. Saibuatong O. A., Phisalaphong M. Novo aloe vera-bacterial cellulose composite film from biosynthesis // Carbohydrate Polymers, 79. – 2010. – P. 455-460.
31. Saska S., Barud H.S., Gaspar A.M.M., Marchetto R., Ribeiro S.J.L, Messaddeq Y. Bacterial cellulose – Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone regeneration // International journal of biomaterials, 2. – 2011. – P. 1-7.
32. Shah N., Ul-Islam M., Khattak W.A., Park J.K. Overview of bacterial cellulose composites: a multipurpose advanced material // Carbohydr. Polym., 98. – 2013. – P. 585-598.
33. Solway D. R., Clark W. A., Levinson D. J. A parallel open-label trial to evaluate microbial cellulose wound dressing in the treatment of diabetic foot ulcers // International Wound Journal, 8. – 2011. – P. 69-73.
34. Son H.J., Heo M.S., Kim Y.G., Lee S.J. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking cultures // Biotechnol Appl Biochem, 33. – 2001. – P. 1–5.
35. Yang X.Y., Huang C., Guo H.J., Xiong L., Luo J., Wang B., Lin X.Q., Chen X.F., Chen X.D. Bacterial Cellulose Production from the Litchi Extract by Gluconacetobacter Xylinus // Prep Biochem Biotechnol, 32. – 2014. – P. 175-176.
References
1. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I. S., “Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology’, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66 (2002): 506.
2. Shah N., Ul-Islam M., Khattak W.A., Park J.K. “Overview of bacterial cellulose composites: a multipurpose advanced material”, Carbohydr. Polym., 98 (2013): 585-598.
3. Klemm D., Heublein B., Fink H.P., Bohn A., “Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material”, J Angew Chem Int Ed, 44 (2005): 3358-3393.
4. Guzun A.S., Stroescu M., Jinga S.I., Voicu G., Grumezescu A.M., Holban A.M., “Plackett-Burman experimental design for bacterial cellulose-silica composites synthesis”, Mater Sci Eng C Mater Biol Appl., 42 (2014): 280.
5. Yang X.Y., Huang C., Guo H.J., Xiong L., Luo J., Wang B., Lin X.Q., Chen X.F., Chen X.D., “Bacterial Cellulose Production from the Litchi Extract by Gluconacetobacter Xylinus”, Prep Biochem Biotechnol, 32 (2014): 175-176.
6. Czaja, W.K., Young, D.J., Kawecki M., Brown R.M., “The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications”, Biomacromolecules, 8 (2007); 1-12.
7. Jeong S.I., Lee S.E., Yang H., Jin Y.H., Park C.S., Park Y.S., “Toxicologic evaluation of bacterial synthesized cellulose in endothelial cells and animals”, Molecular & Cellular Toxicology, 6 (2010): 373-380.
8. Andrade F.K., Moreira S.M., Domingues L., Gama F.M., “Improving the affinity of fibroblasts for bacterial cellulose using carbohydrate-binding modules fused to RGD”, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 92A (2010): 9-17.
9. Dahman Y., “Nanostructured biomaterials and biocomposites from bacterial cellulose nanofibers”, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 9 (2009): 5105–5122.
10. Saska S., Barud H.S., Gaspar A.M.M., Marchetto R., Ribeiro S.J.L, Messaddeq Y., “Bacterial cellulose – Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone regeneration”, International journal of biomaterials, 2 (2011): 1-7.
11. Laçin N.T., “Development of biodegradable antibacterial cellulose based hydrogel membranes for wound healing”, Int J Biol Macromol., 67 (2014): 22-27.
12. Czaja W., Krystynowicz A., Bielecki S., Brown R. J., “Microbial cellulose — the natural power to heal wounds”, Biomaterials, 27 (2006): 145-151.
13. Solway D. R., Clark W. A., Levinson D. J., “A parallel open-label trial to evaluate microbial cellulose wound dressing in the treatment of diabetic foot ulcers”, International Wound Journal, 8 (2011): 69-73.
14. Netrusov А.I., Еgorova М.А., Zaharchuk L.М., Kolotilova N.N. et al. (2005) Practicum po microbiologii: uchebnoye posobiye dlya studentov vysshih uchebnyh zavedenyi [Practicl works on microbiology: textbook for students of higher educational institutions]. Academy, pp. 608.
15. J. Hoult, N. Krig, P. Smith et al. (1997) Opredelitel bakteriy Bergi [Bergi identificator of bacteria]. Mir, vol. 1, pp. 800].
16. Clayton R. A., Sutton G., Hinkle P. S., Bult Jr. C., Fields C., “Intraspecific variation in small-subunit rRNA sequences in GenBank: why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa”, International Journal of Systematic Bacteriology, 45 (1995): 595–599.
17. Clarridge III J. E., “Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases”, Clinical Microbiology Reviews, 17 (2004): 840–862.
18. Cai Z., Kim J., “Bacterial cellulose/poly (ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibilit”, Cellulose, 17 (2010): 83-91.
19. Miller G.L., “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal. Chem. , 31 (1959): 426–429.
20. Pértile R. A, Moreira S., Costa R.M., Correia A., Guardão L., Gartner F., Vilanova M., Gama M., “Bacterial Cellulose: Long-Term Biocompatibility Studies”, J Biomater Sci Polym Ed, 23 (2011): 231-236.
21. Ruka R.D., Simon P.G., Dean K., “Altering the growth conditions of Gluconoacetobacter xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose”, CSIRO Materials Science and Engineering, (2015): 1-21.
22. Romanov D.P., Baklagina Yu.G., Lukasheva N.V., Khripunov A.K., Kachenko A.A., Lavrentyev V.K., Klechkovskaya V.V., Arkharova N.A., Tolmachev D.A., “Investigation of Nanocomposites Based on Hydrated Calcium Phosphates and Cellulose Acetobacter xylinum”, Journal Glass Physics and Chemistry, 34 (2008): 192–200.
23. Ross P., Mayer R., and Benziman M., “Cellulose biosynthesis and function in bacteria”, Microbiol Mol Biol Rev 55, no. 1, pp. (1991): 35-58.
24. Saibuatong O. A., Phisalaphong M., “Novo aloe vera-bacterial cellulose composite film from biosynthesis”, Carbohydrate Polymers, 79 (2010): 455-460.
25. Bae S., Shoda M., “Bacterial cellulose production by fed-batch fermentation in molasses medium”, Biotechnology Progress, 20 (2004): 1366–1371.
26. Czaja W., Romanovicz D., Brown R. M., “Structural investigations of microbial cellulose produced in stationary and agitated culture”, Cellulose, 11 (2004): 403-411.
27. Bodin A., Backdahl H., Fink H., Gustafsson L., Risberg B., Gatenholm P. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng, 97 (2007):425–434.
28. Chawla P.R., Bajaj I.B., Survase A.S., Singhal R.S. Microbial cellulose: fermentative production and application. Food Technol Biotechnol, 47 (2009): 107–124.
29. Mikkelsen D., Flanagan B.M., Dykes G.A., Gidley M.J. Influence of different carbon sources on bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus strain ATCC 53524. J Appl Microbiol, 107 (2009):576–583.
30. Ramana K.V., Tomar A., Singh L. Effect of various carbon and nitrogen sources on cellulose synthesis by Acetobacter xylinum. World J Microbiol Biotechnol, 16 (2000):245–248.
31. Son H.J., Heo M.S., Kim Y.G., Lee S.J. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking cultures. Biotechnol Appl Biochem, 33 (2001):1–5.
32. Naritomi T., Kouda T., Yano H., Yoshinaga F. Effect of ethanol on bacterial cellulose production from fructose in continuous culture. J Ferment Bioeng, 85 (1998):598–603.
33. Backdahl H., Helenius G., Bodin A., Nannmark U., Johansson B. R., Risberg B., Gatenholm P., “Mechanical properties of bacterial cellulose and interaction swith smooth muscle cells”, Biomaterials. 27 (2006): 2141-2149.
34. Nge T. T., Nogi M., Yano H., Sugiyama J., “Microstructure and mechanical properties of bacterial cellulose/chitosan porous scaffold”, Cellulose, 17 (2010): 349-363.
35. Lin W.C., Lien C.C., Yeh H.J., Yu C.M., Hsu S.H., “Bacterial cellulose and bacterial cellulose-chitosan membranes for wound dressing applications”, Carbohydr Polym, 94 (2013): P. 603-611.
