КЛОНИРОВАНИЕ КДНК-ГЕНА РИБОСОМНОГО БЕЛКА S6 ИЗ ARABIDOPSIS THALIANA, ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В ESCHERICHIA COLI И ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ATRPS6A1
DOI:
https://doi.org/10.26577/eb.2022.v91.i2.012Ключевые слова:
фосфорилирование, клонирование, рекомбинантный белок, рибосомный белок S6 растений (pRPS6)Аннотация
Рибосомный белок S6 (RPS6) является компонентом эукариотических 40S-рибосомных субъединиц (40S-RSu), который регулирует трансляцию определенных видов мРНК. Поскольку RPS6 – единственный белок 40S-RSu, способный к фосфорилированию, он и является одной из мишеней для регуляции биосинтеза белков у эукариот. Есть указание на то, что рибосомы с наиболее высоким уровнем фосфорилирования RPS6 создают селективные преимущества при трансляции мРНК, кодирующих большую часть белковых компонентов трансляционного аппарата клеток. Понимание механизма регуляции биосинтеза у растений посредством фосфорилирования pRPS6 позволит повышать биомассу растений и их урожайность.
В настоящей работе кДНК-ген AtRPS6A1, кодирующий рибосомный белок S6, клонирован в векторе pET19b. Этот ген экспрессирован в клетках Escherichia coli, а кодируемый им рекомбинантный белок PRS6 выделен методами ионной и аффинной (IMAC-) хроматографии, очищен диализом и сконцентрирован. Белок PRS6 будет использован в экспериментах in vitro для исследования молекулярных механизмов регуляции трансляции мРНК растений посредством его фосфорилирования и получения моноклональных антител к этому белку.
Библиографические ссылки
Borlaug N. Feeding a hungry world // Science. – 2007. – Vol. 318. – P. 359-359.
Van Camp W. Yield enhancement genes: seeds for growth // Curr. Opin. Plant Biol. – 2005. – Vol. 16. – P. 147-153.
Meinke D.W., Cherry J.M., Dean C., Rounsley S.D., Koornneef M. Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analy- sis. // Science. – 1998. – Vol. 282. – P. 679–682.
Zhang J.Z., Creelman R.A., Zhu J.-K. From laboratory to field. Using information from Arabidopsis to engineer salt, cold, and drought tolerance in crops // Plant Physiol. – 2004. – Vol. 135. – P. 615-621.
Turck F., Kozma S.C., Thomas G., Nagy F. A heat-sensitive Arabidopsis thaliana kinase substitutes for human p70s6k function in vivo // Mol. Cell. Biol. – 1998. – Vol. 18. – P. 2038-2044.
Ryabova L.A., Robaglia Ch., Meyer Ch. Target of Rapamycin kinase: central regulatory hub for plant growth and metabo- lism // J Exp. Bot. – 2019. – Vol.70, No.8. – P. 2211–2216.
Ren M., Qiu S., Venglat P., Xiang D., Feng L., Selvaraj G., Datla R. Target of rapamycin regulates development and ribo- somal RNA expression through kinase domain in Arabidopsis // Plant Physiol. – 2011. –Vol.155. – P. 1367-1382.
Roustan V., Jain A, Teige M., Ebersberger I, Weckwerth W. An evolutionary perspective of AMPK–TOR signaling in the three domains of life // J Exp. Bot. – 2016. – Vol. 67, No 13 – P. 3897-3907.
Nandagopal N., Roux P.P. Regulation of global and specific mRNA translation by the mTOR signaling pathway // Transla- tion. – 2015. – Vol. 3, No. 1.
Henriques R., Bögre L., Horváth B., Magyar Z. Balancing act: matching growth with environment by the TOR signalling pathway // J Exp. Bot. – 2014. – Vol.65, No.10 – P. 2691-2701
Caldana C., Martins M.C.M., Mubeen U., Urrea-Castellanos R. The magic ‘hammer’ of TOR: the multiple faces of a single pathway in the metabolic regulation of plant growth and development // J Exp. Bot. – 2019. – Vol.70. – P. 2217-2225.
Menand B., Desnos T., Nussaume L., Berger F., Bouchez D., Meyer C., Robaglia C. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2002. – Vol. 99. – P. 6422–6427.
Rexin D., Meyer Ch., Robaglia Ch., Veit B. TOR signalling in plants // Biochem. J. – 2015. – Vol. 470. – P. 1–14.
Wolters H., Jürgens G. Survival of the flexible: hormonal growth control and adaptation in plant development // Nat. Rev. Genet. – 2009. – Vol. 10. – P. 305-317.
Creff A., Sormani R., Desnos T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent // Plant Mol. Biol. – 2010. – Vol. 73. – P. 533-546.
Ruvinsky, I., and Meyuhas, O. Ribosomal protein S6 phosphorylation: From protein synthesis to cell size // Trends Bio- chem. Sci. – 2006. – Vol. 31. – P. 342–348.
Meyuhas O. Ribosomal Protein S6 Phosphorylation: Four Decades of Research // Intl Review Cell & Mol. Biol. – 2016. – Vol. 320. – P. 1-33.
Turck F., Zilbermann F., Kozma S.C., Thomas G., Nagy F. Phytohormones Participate in an S6 Kinase Signal Transduction Pathway in Arabidopsis // Plant Physiol. – 2004. – Vol. 134. – P. 1527-1535.
Otterhag L., Gustavsson N., Alsterfjord M., Pical C., Lehrach H., Gobom J., Sommarin M. Arabidopsis PDK1: identifica- tion of sites important for activity and downstream phosphorylation of S6 kinase // Biochimie. – 2006. – Vol. 88. – P. 11–21.
Williams A.J., Werner-Fraczek J. Chang I.-F., Bailey-Serres J. Regulated Phosphorylation of 40S Ribosomal Protein S6 in Root Tips of Maize // Plant Physiol. – 2003. – Vol. 132. – P. 2086–2097.
Yamashita R., Suzuki Y., Takeuchi N., Wakaguri H., Ueda T., Sugano S., Nakai K. Comprehensive detection of human terminal oligo-pyrimidine (TOP) genes and analysis of their characteristics // Nucl. Acids Res. – 2008. – Vol. 36, No. 11. – P. 3707– 3715.
Meyuhas O., Kahan T. The race to decipher the top secrets of TOP mRNAs // Biochim. Biophys. Acta. – 2015. – Vol. 1849.
– P. 801-811.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227. – P. 680-685.
Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: A laboratory manual: 3 volumes. – Third edition. – New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – Vol.7, No.72. – P. 248-254.
