Выделение и характеристика кДНК гена поли(АДФ-рибоза) полимеразы 2 Arabidopsis thaliana

Анотація

Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) катализирует синтез полимеров АДФ-рибозы, ковалентно-прикрепленные к акцепторным белкам, при этом донором остатков АДФ-рибозы выступает НАД⁺. Геном Arabidopsis thaliana, широко используемого модельного растительного организма, кодирует по меньшей мере три предполагаемых PARP фермента: АtPARP1 (At4g02390), AtPARP2 (At2g31320) и AtPARP3 (At5g22470). PARP растений являются структурно гомологичными к PARP белкам млекопитающих. Высокая степень консервативности на уровне аминокислотной последовательности между ферментами арабидопсиса и млекопитающих позволяет предположить, что в растениях PARP выполняет аналогичные функции как в животных системах. Однако в  отличие от млекопитающих, значительно мало известно о поли-АДФ-рибозилирований в растениях.

Нами был выделен кДНК ген AtPARP2 с применением реакции обратной транскрипции (РОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Осуществлена функциональная экспрессия AtPARP2 гистидиновым концом в E. cоli и очищена никель аффинной хроматографией до гомогенного состояния. С помощью MALDI-TОF масс-спектрометрии установлена принадлежность рекомбинантного белка к семейству поли(АДФ-рибоза)-полимераз. Выявлено, что продуктом экспрессии гена является глобулярный белок массой 72,2 кДа, состоящий из 637 аминокислот (pI 5,92).  На основе очищенного рекомбинантного AtPARP2 были получены поликлональные антитела к AtPARP2. AtPARP2 в присутствии олигонуклеотидного дуплекса с разрывом и НАД+ показал авто-поли(АДФ-рибозил)ирующию активность.

Ключевые слова: поли(АДФ-рибоза) полимераза, PARP2, поли-АДФ-рибозилирование, НАД+ радикалы кислорода, Arabidopsis thaliana.