Клонирование кднк гена поли(АДФ-рибоза) полимеразы 2 Arabidopsis thaliana в Saccharomyces cerevisiae

S. M. Taipakova; A. K. Kuanbay; D. Manatkyzy; I. T. Smekenov; S. D. Alybayev; А. К. Bissenbaev

doi:10.26577/eb.2020.v84.i3.08

Авторы

S. M. Taipakova Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы
A. K. Kuanbay Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы
D. Manatkyzy Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы
I. T. Smekenov Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы
S. D. Alybayev Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы
А. К. Bissenbaev Лаборатория молекулярной генетики, Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии, Казахстан, г. Алматы

DOI:

https://doi.org/10.26577/eb.2020.v84.i3.08

Аннотация

Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) катализирует синтез полимеров АДФ-рибозы ковалентно-прикрепленные к акцепторным белкам. При этом донором остатков АДФ-рибозы выступает НАД⁺. Одной из наиболее известных ролей PARP является их функция в качестве сенсора повреждения ДНК. PARP1, в частности, связывается в поли(АДФ-рибозил)ированной форме с разрывами ДНК и привлекает белковую машину репарации ДНК в места повреждения ДНК. Недавно, впервые показано, что PARP поли-АДФ-рибозилирует не только белки, но и концы разрывов ДНК. Однако, в настоящее время нет прямых доказательств наличия поли-АДФ-рибозилированных ДНК-аддуктов в условиях in vivo как в животных, так и в растениях.

В клетках Saccharomyces cerevisiae отсутствует PARP активность, несмотря на то, что он обнаружен в организмах от архебактерий до млекопитающих. Из-за простоты манипулирования и генетической трактуемости дрожжи S. cerevisiae были использованы для анализа функции многих белков из клеток животных и растений. В связи с этим целью нашей работы является клонирование и гетерологичная экспрессия гена AtPARP2 из модельного растения Arabidopsis thaliana в дрожжах.

С применением генно-инженерных методов нами сконструирована рекомбинантная плазмида с кДНК геном AtPARP2 под контролем индуцибельного промотора GAL10 эписомального вектора pESC-LEU2. Методом генетической трансформации получен рекомбинантный штам S. cerevisiae, способный экспрессировать кДНК ген АtPARP2. Методом Вестерн-блоттинга с применением полученных нами поликлональных анти-АtPARP2 антител выявлено, что продуктом экспрессии гена в дрожжах является глобулярный белок массой 72 кДа, состоящий из 637 аминокислот (pI 5,92). Показано незначительное ингибирование роста в дрожжевых клетках FF 18733, экспрессирующих АtPARP2. Индукция экспрессии AtPARP2 в дрожжевых клетках, выявило PARилирующию активность белка in vivo. Показано авто-поли(АДФ-рибозил)ирующая активность AtPARP2 в дрожжах в ответ на двухцепочечные разрывы ДНК, индуцированные обработкой клеток блеомицином. Ингибитор PARP фермента 3-АВ значительно ингибировал количество поли АДФ-рибозилированных белковых продуктов.

Ключевые слова: Поли(АДФ-рибоза) полимераза, AtPARP2, поли-АДФ-рибозилирование, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisae.