Arabidopsis thaliana поли(АДФ-рибоза) полимераза 2 кднк генін Saccharomyces cerevisiae жүйесінде клондау

Аңдатпа

Поли(АДФ-рибоза) полимераза (PARP) акцепторлы ақуызға ковалентті-бекітілген АДФ-рибоза полимерлерінің синтезін катализдейді. Бұл ретте, АДФ-рибоза қалдығының доноры НАД+ болып табылады. PARP белгілі қызметтерінің ішінде айрықша көзге түсетіні - оның ДНҚ зақымдануының сенсоры ретінде әрекет етуі. Атап айтқанда, PARP1 поли(АДФ-рибозил)денген күйде ДНҚ үзілістерімен байланысып, ДНҚ зақымданған аймаққа ДНҚ репарациясының ақуыздық жүйесін шақырады. Жақында, алғаш рет, PARP тек ақуыздарды ғана емес, сонымен қатар ДНҚ үзілістерінің соңдарын да поли(АДФ-рибозил)дейтіні көрсетілді. Алайда, қазіргі таңда жануарлар мен өсімдіктерде in vivo жағдайда поли(АДФ-рибозил)денген ДНҚ аддукттары болуының нақты дәлелі жоқ.

Архебактериядан сүтқоректілерге дейінгі ағзалардың барлығында табылғандығына қарамастан, Saccharomyces cerevisae клеткаларында PARP белсенділігі анықталмаған. Манипуляция жүргізу және генетикалық тұрғыдан түсіндіру жеңілдігіне байланысты S. cerevisiae ашытқылары өсімдік және жануар клеткаларының көптеген белоктарының функцияларын талдау мақсатында қолданылған. Осыған байланысты, біздің жұмысымыздың мақсаты Arabidopsis thaliana модельді өсімдігінің AtPARP2 генін ашытқыларда клондау және гетерологиялық экспрессиялау болып табылады.

Гендік инженерия әдістерінің көмегімен pESC-LEU2 эписомальды векторының GAL10 индуцебельді промоторының бақылауындағы AtPARP2 генінің кДНҚ-сы бар рекомбинатты плазмида құрастырылды. Генетикалық трансформация әдісі арқылы AtPARP2 генінің кДНҚ-н экспрессиялауға қабілетті S. cerevisiae рекомбинатты штаммы алынды. Анти-AtPARP2 поликлональды антиденелерін қолдану арқылы жүргізілген Вестерн-блоттинг әдісінің нәтижесінде ашытқылардағы ген экспрессиясының өнімі  массасы 72 кДа, 637 аминқышқылынан (pI 5.92) тұратын глобулярлы ақуыз екендігі анықталды. AtPARP2 экспрессиялайтын FF 18733 ашытқы клеткаларында өсудің шамалы тежелетіні көрсетілген. Ашытқы клеткаларындағы AtPARP2 экспрессиясының индукциясы  ақуыздың  PARилдеуші белсендігін in vivo айқындады. Клеткалардың блеомицинмен өңделуі нәтижесінде индуцирленген қостізбекті ДНҚ үзілістеріне жауап ретінде ашытқыларда AtPARP2-ң авто- поли(АДФ-рибозил)деуші белсенділігі көрсетілген. PARP ферментінің ингибиторы, 3-АВ поли(АДФ-рибозил)денген ақуыздық өнімдердің мөлшерін айтарлықтай тежеді.

Кілтті сөздер: Поли(АДФ-рибоза) полимераза, AtPARP2, поли(АДФ-рибозил)дену, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisae