TORC1 СИГНАЛДЫ ЖҮЙЕСІНІҢ КОМПОНЕНТІ TRITICUM AESTIVUM РЕКОМБИНАНТТЫ LST8/GΒL ГОМОЛОГЫНА ПОЛИКЛОНАЛДЫ АНТИДЕНЕЛЕР АЛУ
DOI:
https://doi.org/10.26577/eb.2021.v88.i3.10Кілттік сөздер:
Triticum aestivum, LST8, протеин экспрессиясы, поликлоналды антиденелер, иммундық-ферменттік талдау.Аннотация
LST8 – эукариот клеткаларының пролиферациясы мен өсуінің негізгі реттеушісі болып табылатын TOR сигналдық жүйесінің негізгі компоненті. Бұл жұмыста бидайдың LST8 (TaLST8) белогына спецификалық поликлоналды антиденелер алынды және оларға сипаттама берілді. Толық TaLST8 белогының кДНҚ гені кері транскриптаза негізіндегі ПТР арқылы бөлініп алынды. TaLST8 аминқышқылдарының реттілігін талдау, оның ашытқы (55% сәйкестік), адамның (51% сәйкестік) және арабидописис өсімдігінің (85% сәйкестік) LST8 белоктарымен жоғары гомологияны көрсететіндігі анықталды. TaLST8-ге қарсы антиденелерді алу үшін, 150 аминқышқылынан тұратын белокты кодтайтын TaLST8 генінің жоғары деңгейдегі консервативті бөлігін (talst8/150) pET-28c векторына клондадық. Қояндар тазартылған рекомбинантты TaLST8/150 белогымен иммунизацияланды. Алынған антисарысу, антиденелердің спецификалылығын арттыру үшін аффиндік жолмен тазартылды. Өндірілген антиденелердің спецификалылығы иммуноферменттік талдау, иммуноблотинг және иммунодоттық зерттеу арқылы талданды. Иммуноферменттік талдау, тазартылған 6xHis-TaLST8/150 белогы негізінде иммунизациялау, жоғары титрлі (1:64000) және спецификалық дәрежесі жоғары поликлоналды антиденелердің пайда болуына алып келді. TaLST8-ге қарсы антиденелер иммуноблотинг және иммунодотты талдауларда денатурацияланбаған және денатурацияланған белокты нақты анықтауға мүмкіндік беретінін көрсетті.
Рекомбинантты TaLST8/150 белогына қарсы алынған тазартылған поликлоналды антиденелер айтарлықтай спецификалық көрсетті және болашақта бидай өсімдіктеріндегі TOR сигналдық жүйесінің қызметін түсіну бағытында, пайдалы құрал болуы мүмкін.
Библиографиялық сілтемелер
Loewith R., Hall M.N. (2011) Target of rapamycin (TOR) in nutrient signaling and growth control. Genetics., vol. 189, pp. 1177–1201.
Saxton R.A., Sabatini D.M. (2017) mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell., vol. 168., pp. 960–976.
Hara K., Maruki Y., Long X., Yoshino K., Oshiro N., Hidayat S., Tokunaga C., Avruch J., Yonezawa K. (2002) Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action. Cell., vol. 110, pp. 177–189.
Kim D.H., Sarbassov D.D., Ali S.M., Latek R.R., Guntur K.V., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. (2003) GbetaL, a positive regulator of the rapamycin-sensitive pathway required for the nutrient-sensitive interaction between raptor and mTOR. Mol. Cell.,vol. 11, pp. 895–904.
Loewith R., Jacinto E., Wullschleger S., Lorberg A., Crespo J.L., Bonenfant D., Oppliger W., Jenoe P., Hall M.N. (2002) Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control. Mol. Cell., vol. 10, pp. 457–468.
Roberg K.J., Bickel S., Rowley N., Kaiser C.A. (1997) Control of amino acid permease sorting in the late secretory pathway of Saccharomyces cerevisiae by SEC13, LST4, LST7 and LST8. Genetics.,vol. 147, pp. 1569–1584.
Neer E.J., Schmidt C.J., Nambudripad R., Smith T.F. (1994) The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature., vol. 371, p. 297–300.
Smith T.F., Gaitatzes C., Saxena K., Neer E.J. (1999) The WD repeat: A common architecture for diverse functions. Trends Biochem. Sci., vol. 24, pp. 181–185.
Adami A., Garcı´a-Alvarez B., Arias-Palomo E., Barford D., Llorca O. (2007) Structure of TOR and its complex with KOG1. Mol. Cell., vol. 27, pp. 509–516.
You D.J., Kim Y.L., Park C.R., Kim D.K., Yeom J., Lee C., Ahn C., Seong J.Y., Hwang J.I. (2010) Regulation of IkB kinase by GbL through recruitment of the protein phosphatases. Mol. Cells.vol. 30, pp. 527–532.
Guertin D.A., Stevens D.M., Thoreen C.C., Burds A.A., Kalaany N.Y., Moffat J., Brown M., Fitzgerald K.J., Sabatini D.M. (2006) Ablation in mice of the mTORC components raptor, rictor, or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKCalpha, but not S6K1. Dev. Cell., vol. 11, pp. 859–871.
Menand B., Desnos T., Nussaume L., Berger F., Bouchez D., Meyer C., Robaglia C. (2002) Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, pp. 6422–6427.
Anderson G. H., Veit B., Hanson M. R. (2005) The Arabidopsis AtRaptor genes are essential for post-embryonic plant growth. BMC Biology., vol. 3, pp. 12.
Deprost D., Truong H. N., Robaglia C., Meyer C. (2005) An Arabidopsis homolog of RAPTOR/KOG1 is essential for early embryo development. Biochemical and Biophysical Research Communications., vol. 326, pp. 844-850.
Mahfouz M.M., Kim S., Delauney A.J., Verma D.P. (2006) Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN interacts with RAPTOR, which regulates the activity of S6 kinase in response to osmotic stress signals. The Plant Cell., vol. 18, pp. 477- 490.
Rexin D., Meyer C., Robaglia C., Veit B. (2015) TOR signalling in plants. Biochemical Journal.,vol. 470, pp. 1-14.
Salem M.A., Li Y., Bajdzienko K., Fisahn J., Watanabe M., Hoefgen R., Schottler M.A., Giavalisco P. (2018) RAPTOR controls developmental growth transitions by altering the hormonal and metabolic balance. Plant Physiology., vol. 177, pp. 565-593.
Moreau M., Azzopardi M., Clement G., Dobrenel T., Marchive C., Renne C., Martin-Magniette M.L., Taconnat L., Renou J.-P., Robaglia C., Meyer C. (2012) Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GbetaL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell., vol. 24, pp. 463-481.
Giraldo P., Benavente E., Manzano-Agugliaro F., Gimenez E. (2019) Worldwide research trends on wheat and barley: A bibliometric comparative analysis. Agronomy.,vol. 9, pp. 352.
Gupta P.K., Mir R.R., Mohan A., Kumar J. (2008) Wheat Genomics: Present Status and Future Prospects. Int J Plant Genomics.vol. 2008, pp. 896451.
Bordeaux J., Welsh A.W., Agarwal S., Killiam E., Baquero M.T., Hanna J.A., Anagnostou V.K., Rimm D.L. (2010) Antibody validation. Biotechniques., vol. 48, pp. 197–209.
Zanoni R.G., Nauta I.M., Pauli U., Peterhans E. (1991) Expression in Escherichia coli and sequencing of the coding region for the capsid protein of Dutch maedi-visna virus strain ZZV 1050: application of recombinant protein in enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of caprine and ovine lentiviruses. J Clin Microbiol.,vol. 29, pp. 1290–1294.
Molinkova D. (2001) Purification of Escherichia coli-expressed HIS-tagged Maedi-Visna p25 core antigen by Ni2+-chelate affinity chromatography. Vet Med-Czech., vol. 46, pp. 50–54.
Bass J.J., Wilkinson D.J., Rankin D., Phillips B.E., Szewczyk N.J., Smith K., Atherton P.J. (2017) An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports., vol. 27, pp. 4–25.
Akishev Z., Taipakova S., Joldybayeva B., Zutterling C., Smekenov I., Ishchenko A.A., Zharkov D.O., Bissenbaev A.K., Saparbaev M. (2016) The major Arabidopsis thaliana apurinic/apyrimidinic endonuclease, ARP is involved in the plant nucleotide incision repair pathway. DNA Repair., vol. 48, pp. 430 – 421.
