УНИВЕРСАЛЬНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЗОНД ВЫЯВЛЯЮТ РЕФЕРЕНТНЫЙ ГЕН 18S рРНК У ВСЕХ ПОЗВОНОЧНЫХ
DOI:
https://doi.org/10.26577/eb.2022.v92.i3.010Ключевые слова:
ПЦР-в-Реальном-Времени, 18S рРНК, референсный ген, позвоночные, ген внутреннего контроляАннотация
Аннотация. Детекция генов-мишеней с помощью тест-систем на основе ПЦР-в-Реальном-Времени требует одновременного обнаружения гена внутреннего контроля, чтобы избежать ложноотрицательных результатов. Гены эндогенного внутреннего контроля (референсные гены) имеют преимущество перед экзогенным внутренним контролем (ВК), поскольку они являются частью клеточной хромосомной ДНК организма. Однако референсные гены имеют и недостаток, поскольку они различаются для каждого биологического вида, что приводит к дополнительной разработке праймеров и флуоресцентных зондов для каждого отдельного биологического вида, что требует времени и средств. В последние годы значительное количество исследований посвящено разработке универсальных наборов праймеров/зондов, способных обнаруживать референсный ген в широком круге биологических объектов – целого класса или даже живого царства. Такие универсальные наборы праймеров/зондов ведут к унификации тестов на основе ПЦР-в-Реальном-Времени, используемых в диагностических целях. В данной работе представлен такой набор для определения референсного гена 18S рРНК у видов, входящих в подтип Vertebrata. В ходе исследования с помощью разработанного набора в образцах ДНК млекопитающих, завропсид, амфибий и костных рыб ген 18S рРНК детектировался со 100%-ной специфичностью. Этот набор был также исследован в различных мультиплексных реакциях ПЦР-в-Реальном-Времени – специфичность и чувствительность набор сохранял вплоть до увеличения числа мишеней до четырёх в тесте (тетраплекс).
Библиографические ссылки
Ahmed W., Simpson S.L., Bertsch P.M., Bibby K., Bivins A., Blackall L.L., Bofill-Mas S., et al. (2022) Minimizing errors in RT-PCR detection and quantification of SARS-CoV-2 RNA for wastewater surveillance. Science of The Total Environment, vol. 805, 149877. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.149877.
Pecoraro V., Negro A., Pirotti T., Trenti T. (2022) Estimate false-negative RT-PCR rates for SARS-CoV-2. A systematic review and meta-analysis. Eur J Clin Invest. vol. 52(2), e13706. doi:10.1111/eci.13706.
Wilson C.C., Wozney K.M., Smith C.M. (2016) Recognizing false positives: synthetic oligonucleotide controls for environmental DNA surveillance. Methods in Ecology and Evolution, vol. 7, pp.23-29. doi: 10.1111/2041-210X.12452.
Dingle K.E., Crook D., Jeffry K. (2004) Stable and noncompetitive RNA internal control for routine clinical diagnostic reverse transcription PCR. Journal of Clinical Microbiology, vol. 42, pp. 1003-1011. https://doi:10.1128/JCM.42.3.1003-1011.2004
Kozera B., Rapacz M. (2013) Reference genes in real-time PCR. J Appl Genet., vol. 54(4), pp. 391-406. https://doi:10.1007/s13353-013-0173-x
Wang Y., Zhang J., Patrick K. et al. (2020) Hydroxymethylbilane synthase (HMBS) gene-based endogenous internal control for avian species. AMB Expr., vol. 10(181), https://doi.org/10.1186/s13568-020-01112-5
Modarelli J.J., Ferro P.J., Esteve-Gasent M.D. (2018) Development and application of a canine endogenous internal positive control for use in real-time PCR assays. J Vet Diagn Invest., vol. 30(5), pp. 789-792. https://doi: 10.1177/1040638718795206
Mittelberger C., Obkircher L., Oberkofler V., et al. (2020) Development of a universal endogenous qPCR control for eukaryotic DNA samples. Plant Methods, vol. 16(53), https://doi:10.1186/s13007-020-00597-2
Sochorová J., Garcia S., Gálvez F., Symonová R., Kovařík A. (2018) Evolutionary trends in animal ribosomal DNA loci: introduction to a new online database. Chromosoma, vol. 127, pp. 141-150. https://doi.org/10.1007/s00412-017-0651-8
Long E.O., Dawid I.B. (1980) Repeated genes in eukaryotes. Annu Rev Biochem., vol. 49, pp. 727-764. doi:10.1146/annurev.bi.49.070180.003455.
Smirnov E., Chmúrčiaková N., Liška F., Bažantová P., Cmarko D. (2021). Variability of Human rDNA. Cells, vol. 10(2), pp. 196. https://doi.org/10.3390/cells10020196
Ming L., Ying Zh., Xia H., Pengfei W., Peng S., Xianhua Z., Xiangqing M. (2020) Screening method of fir reference gene in different tissues and application of screening gene as reference gene. Patent CN108085409B (Application CN201711463831.2A, 2017-12-28).
Huipeng P., Chunxiao Y., Baoli Q., Jianhui W., Wen S., Xingmin W., Fengliang J. (2017) The reference gene combination and its application of Harmonia axyridia stable expression under the different factors. Patent CN107858438A (Application CN201710949106.XA, 2017-10-12).
Suthanthiran M., Ding R., Schwartz J.E., Shaked A. (2017) Methods to detect, treat and prevent acute cellular rejection in kidney allografts. Patent US9758828B2 (Application US14/170, 2013-01-31).
Wen Y., Tangbiao M., Rong L., Hongmei H., Jie Sh. (2020) Application of 18S RNA in qRT-PCR detection of gene expression before and after ovarian cancer cell hypoxia stimulation. Patent CN110951879B (Application CN201911347514.3A, 2019-12-24).
McKiernan H.E., Danielson P.B. Molecular Diagnostic Applications in Forensic Science. 3d ed. NY: Academic Press; 2017. Chapter 21, Molecular Diagnostics; p. 371-394. doi.org/10.1016/B978-0-12-802971-8.00021-3.
Mueller T., Wullimann M.F. (2016) Comparison of Vertebrate model systems: model systems, in: Mueller T., Wullimann M.F. (Eds.), Atlas of early Zebrafish brain development (Second Edition), Elsevier, pp. 205-226. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-418669-9.00004-0.
Humphray S.J., Scott C.E., Clark R., Marron B., Bender C., Camm N., Davis J., et al. (2007) A high utility integrated map of the pig genome. Genome Biol., vol. 8, R139. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-7-r139
Warr A., Affara N., Aken B., Beiki H., Bickhart D.M., Billis K., Chow W., et al. (2020) An improved pig reference genome sequence to enable pig genetics and genomics research. Gigascience, vol. 9(6), giaa051. https://doi:10.1093/gigascience/giaa051.
Muller P.Y., Janovjak H., Miserez A.R., Dobbie Z. (2002) Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques, vol. 32(6), pp. 1372-1378. PMID: 12074169.
Rebrikov D.V. and Trofimov D.Yu. (2006) Real-Time PCR: A review of approaches to data analysis. Prikl Biokhim Mikrobiol., vol. 42(5), pp. 455-463. PMID: 17066950. (in Russian).
Kralik P., Ricchi M.A (2017) A basic guide to Real Time PCR in microbial diagnostics: definitions, parameters, and everything. Front Microbiol., vol. 8, pp. 108. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108.
Rothschild M.F., Ruvinsky A. (2010) The Genetics of the Pig, 2nd Edition. UK: CABI, 496 p. ISBN-13: 978-1-84593-756-0.
Sochorová J., Gálvez F., Matyášek R., Garcia S., Kovařík A. (2021) Analyses of the Updated “Animal rDNA Loci Database” with an Emphasis on Its New Features. International Journal of Molecular Sciences, vol. 22(21), pp. 11403. https://doi.org/10.3390/ijms222111403.
Mellink C.H.M., Bosma A.A., de Haan N.A., Zijlstra C. (1996) Physical localization of 5s rRNA genes in the pig by fluorescence in situ hybridization. Hereditas, vol. 124, pp. 95-97. https://doi: 10.1111/j.1601-5223.1996.00095.x.
