ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К РЕКОМБИНАНТНОМУ ГОМОЛОГУ LST8/GΒL TRITICUM AESTIVUM, КОМПОНЕНТУ TORС1 СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
DOI:
https://doi.org/10.26577/eb.2021.v88.i3.10Ключевые слова:
Triticum aestivum, LST8, экспрессия белка, поликлональные антитела, иммуноферментный анализ.Аннотация
LST8 является ключевым компонентом TOR сигнальной системы, центрального регулятора клеточной пролиферации и роста эукариотических клеток. В этом исследовании получены и охарактеризованы поликлональные антитела против LST8 Triticum aestivum (TaLST8). Выделен кДНК, кодирующая полный белок TaLST8. Выравнивание аминокислотной последовательности TaLST8 показало высокую гомологию с LST8 дрожжей (55% идентичность), LST8 человека (51% идентичность) и AtLST8 арабидопсиса (85% идентичность). Для получения антител против TaLST8, высококонсервативная часть гена ТаLST8, кодирующая белок, состоящей из 150 аминокислот (talst8/150), была клонирована в pET-28c с гистидиновым концом (6хHis) и экспрессирована в Escherichia coli. Кроликов иммунизировали очищенным рекомбинантным белком TaLST8/150. Полученные антисыворотки очищали для повышения специфичности распознавания. Чувствительность и специфичность продуцируемых антител анализировали с помощью иммуноферментного анализа, иммунблотинга и иммунодот анализа. Иммуноферментный анализ показал, что иммунизация очищенным белком 6хHis-TaLST8/150 продуцировал поликлональные антитела с высоким титром (1:64000) и высокой специфичностью. Антитела против TaLST8 позволили специфичному выявлению нативного и денатурированного белка в иммуноблоттинг и иммуннодот анализе.
Очищенные поликлональные антитела, полученные против рекомбинантного белка TaLST8/150, достаточно специфично и чувствительно и может быть полезным инструментом для будущего понимания функционирования TOR сигнальной системы в растениях пшеницы.
Библиографические ссылки
Loewith R., Hall M.N. (2011) Target of rapamycin (TOR) in nutrient signaling and growth control. Genetics., vol. 189, pp. 1177–1201.
Saxton R.A., Sabatini D.M. (2017) mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell., vol. 168., pp. 960–976.
Hara K., Maruki Y., Long X., Yoshino K., Oshiro N., Hidayat S., Tokunaga C., Avruch J., Yonezawa K. (2002) Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR), mediates TOR action. Cell., vol. 110, pp. 177–189.
Kim D.H., Sarbassov D.D., Ali S.M., Latek R.R., Guntur K.V., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. (2003) GbetaL, a positive regulator of the rapamycin-sensitive pathway required for the nutrient-sensitive interaction between raptor and mTOR. Mol. Cell.,vol. 11, pp. 895–904.
Loewith R., Jacinto E., Wullschleger S., Lorberg A., Crespo J.L., Bonenfant D., Oppliger W., Jenoe P., Hall M.N. (2002) Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control. Mol. Cell., vol. 10, pp. 457–468.
Roberg K.J., Bickel S., Rowley N., Kaiser C.A. (1997) Control of amino acid permease sorting in the late secretory pathway of Saccharomyces cerevisiae by SEC13, LST4, LST7 and LST8. Genetics.,vol. 147, pp. 1569–1584.
Neer E.J., Schmidt C.J., Nambudripad R., Smith T.F. (1994) The ancient regulatory-protein family of WD-repeat proteins. Nature., vol. 371, p. 297–300.
Smith T.F., Gaitatzes C., Saxena K., Neer E.J. (1999) The WD repeat: A common architecture for diverse functions. Trends Biochem. Sci., vol. 24, pp. 181–185.
Adami A., Garcı´a-Alvarez B., Arias-Palomo E., Barford D., Llorca O. (2007) Structure of TOR and its complex with KOG1. Mol. Cell., vol. 27, pp. 509–516.
You D.J., Kim Y.L., Park C.R., Kim D.K., Yeom J., Lee C., Ahn C., Seong J.Y., Hwang J.I. (2010) Regulation of IkB kinase by GbL through recruitment of the protein phosphatases. Mol. Cells.vol. 30, pp. 527–532.
Guertin D.A., Stevens D.M., Thoreen C.C., Burds A.A., Kalaany N.Y., Moffat J., Brown M., Fitzgerald K.J., Sabatini D.M. (2006) Ablation in mice of the mTORC components raptor, rictor, or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKCalpha, but not S6K1. Dev. Cell., vol. 11, pp. 859–871.
Menand B., Desnos T., Nussaume L., Berger F., Bouchez D., Meyer C., Robaglia C. (2002) Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, pp. 6422–6427.
Anderson G. H., Veit B., Hanson M. R. (2005) The Arabidopsis AtRaptor genes are essential for post-embryonic plant growth. BMC Biology., vol. 3, pp. 12.
Deprost D., Truong H. N., Robaglia C., Meyer C. (2005) An Arabidopsis homolog of RAPTOR/KOG1 is essential for early embryo development. Biochemical and Biophysical Research Communications., vol. 326, pp. 844-850.
Mahfouz M.M., Kim S., Delauney A.J., Verma D.P. (2006) Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN interacts with RAPTOR, which regulates the activity of S6 kinase in response to osmotic stress signals. The Plant Cell., vol. 18, pp. 477- 490.
Rexin D., Meyer C., Robaglia C., Veit B. (2015) TOR signalling in plants. Biochemical Journal.,vol. 470, pp. 1-14.
Salem M.A., Li Y., Bajdzienko K., Fisahn J., Watanabe M., Hoefgen R., Schottler M.A., Giavalisco P. (2018) RAPTOR controls developmental growth transitions by altering the hormonal and metabolic balance. Plant Physiology., vol. 177, pp. 565-593.
Moreau M., Azzopardi M., Clement G., Dobrenel T., Marchive C., Renne C., Martin-Magniette M.L., Taconnat L., Renou J.-P., Robaglia C., Meyer C. (2012) Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GbetaL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell., vol. 24, pp. 463-481.
Giraldo P., Benavente E., Manzano-Agugliaro F., Gimenez E. (2019) Worldwide research trends on wheat and barley: A bibliometric comparative analysis. Agronomy.,vol. 9, pp. 352.
Gupta P.K., Mir R.R., Mohan A., Kumar J. (2008) Wheat Genomics: Present Status and Future Prospects. Int J Plant Genomics.vol. 2008, pp. 896451.
Bordeaux J., Welsh A.W., Agarwal S., Killiam E., Baquero M.T., Hanna J.A., Anagnostou V.K., Rimm D.L. (2010) Antibody validation. Biotechniques., vol. 48, pp. 197–209.
Zanoni R.G., Nauta I.M., Pauli U., Peterhans E. (1991) Expression in Escherichia coli and sequencing of the coding region for the capsid protein of Dutch maedi-visna virus strain ZZV 1050: application of recombinant protein in enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of caprine and ovine lentiviruses. J Clin Microbiol.,vol. 29, pp. 1290–1294.
Molinkova D. (2001) Purification of Escherichia coli-expressed HIS-tagged Maedi-Visna p25 core antigen by Ni2+-chelate affinity chromatography. Vet Med-Czech., vol. 46, pp. 50–54.
Bass J.J., Wilkinson D.J., Rankin D., Phillips B.E., Szewczyk N.J., Smith K., Atherton P.J. (2017) An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports., vol. 27, pp. 4–25.
Akishev Z., Taipakova S., Joldybayeva B., Zutterling C., Smekenov I., Ishchenko A.A., Zharkov D.O., Bissenbaev A.K., Saparbaev M. (2016) The major Arabidopsis thaliana apurinic/apyrimidinic endonuclease, ARP is involved in the plant nucleotide incision repair pathway. DNA Repair., vol. 48, pp. 430 – 421.
