Получение мутантных форм микобактериальной АП эндонуклеазы MtbXthA / Микобактериалды АП эндонуклеазаның MtbXthA мутантты түрін алу

Анотація

Апуриндік/апиримидиндік (AП) эндонуклеазалар үзілген ДНҚ тізбектерінің және негізі жоқ сайттардың репарациясына қатысатын ең басты ферменттер болып табылады. Патогенді Mycobacterium tuberculosis III эндонуклеаза және IV эндонуклеазаларға жататын, сәйкесінше, MtbXthA және MtbNfo екі АП эндонуклеазаға ие. Белгілі болғандай, MtbXthA және MtbNfo ферменттерінде АП эндонуклеазды және 3'→5' экзонуклеазды белсендік бар. Берілген жұмыста MtbXthA рекомбинантты ақуызының клондалуы, экспрессиясы және тазалануы сипатталған. Алынған нәтижелер MtbXthA ақуызында АП эндонуклеазды, 3'-фосфодиэстеразды және 3'→5' бейспецификалық экзонуклеазды белсендіктер бар екендігін көрсетті. Көріп отырған ДНҚ репарация белсендіктер E.coli эндонуклеазалардың қоспасы еместігін дәлел деу үшін MtbXthA - MtbXthA-D180N және MtbXthA-N182A мутанттары алынды.Жүргізілген талдау, MtbXthA-гі табылған D180N және N182A мутациялар белсендік үшін маңызды болып шықты. Апуриновые/апиримидиновые (AП) эндонуклеазы являются ключевыми ферментами, участвующими в репарации безосновных сайтов и разрывах цепей ДНК. Патогенная бактерия Mycobacterium tuberculosis содержит две AП эндонуклеазы: MtbXthA и MtbNfo, которые являются представителями семейств экзонуклеаза III и эндонуклеаза IV, соответственно. Известно, что оба фермента MtbXthA и MtbNfo содержат AП эндонуклеазную и 3'→5' экзонуклеазную активности. В данной работе описывается клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного белка MtbXthA. Результаты показали, что MtbXthA содержит АП эндонуклеазную, 3'-фосфодиэстеразную и 3'→5' неспецифическую экзонуклеазную активности. Чтобы убедиться, что наблюдаемые виды активности репарации ДНК не являются результатом загрязнения эндонуклеазами E.coli, были сделаны мутанты MtbXthA - MtbXthA-D180N и MtbXthA-N182A. Анализ показал, что найденные мутации D180N и N182A в MtbXthA имеют решающее значение для активности ферментов.