Получение мутантных форм микобактериальной АП эндонуклеазы MtbXthA / Микобактериалды АП эндонуклеазаның MtbXthA мутантты түрін алу
Ключевые слова:
репарация ДНК, туберкулез, АП эндонуклеазы, генетическая инженерия, геномная стабильность. DNA repair, tuberculosis, AP endonucleases, genetic engineering, genomic stability. ДНҚ репарация, АП эндонуклеазалар, генетикалық инженерия, геномдық тұрақтылық.Аннотация
Апуриндік/апиримидиндік (AП) эндонуклеазалар үзілген ДНҚ тізбектерінің және негізі жоқ сайттардың репарациясына қатысатын ең басты ферменттер болып табылады. Патогенді Mycobacterium tuberculosis III эндонуклеаза және IV эндонуклеазаларға жататын, сәйкесінше, MtbXthA және MtbNfo екі АП эндонуклеазаға ие. Белгілі болғандай, MtbXthA және MtbNfo ферменттерінде АП эндонуклеазды және 3'→5' экзонуклеазды белсендік бар. Берілген жұмыста MtbXthA рекомбинантты ақуызының клондалуы, экспрессиясы және тазалануы сипатталған. Алынған нәтижелер MtbXthA ақуызында АП эндонуклеазды, 3'-фосфодиэстеразды және 3'→5' бейспецификалық экзонуклеазды белсендіктер бар екендігін көрсетті. Көріп отырған ДНҚ репарация белсендіктер E.coli эндонуклеазалардың қоспасы еместігін дәлел деу үшін MtbXthA - MtbXthA-D180N және MtbXthA-N182A мутанттары алынды.Жүргізілген талдау, MtbXthA-гі табылған D180N және N182A мутациялар белсендік үшін маңызды болып шықты. Апуриновые/апиримидиновые (AП) эндонуклеазы являются ключевыми ферментами, участвующими в репарации безосновных сайтов и разрывах цепей ДНК. Патогенная бактерия Mycobacterium tuberculosis содержит две AП эндонуклеазы: MtbXthA и MtbNfo, которые являются представителями семейств экзонуклеаза III и эндонуклеаза IV, соответственно. Известно, что оба фермента MtbXthA и MtbNfo содержат AП эндонуклеазную и 3'→5' экзонуклеазную активности. В данной работе описывается клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного белка MtbXthA. Результаты показали, что MtbXthA содержит АП эндонуклеазную, 3'-фосфодиэстеразную и 3'→5' неспецифическую экзонуклеазную активности. Чтобы убедиться, что наблюдаемые виды активности репарации ДНК не являются результатом загрязнения эндонуклеазами E.coli, были сделаны мутанты MtbXthA - MtbXthA-D180N и MtbXthA-N182A. Анализ показал, что найденные мутации D180N и N182A в MtbXthA имеют решающее значение для активности ферментов.Библиографические ссылки
1. World Health Organisation. Global Tuberculosis Report 2013 //. - 2013.
2. Schlosser-Silverman E., Elgrably-Weiss M., Rosenshine I., Kohen R., Altuvia S. Characterization of Escherichia coli DNA lesions generated within J774 macrophages // J Bacteriol. - 2000. - T. 182. - № 18. - C. 5225-30.
3. Olano J., Lopez B., Reyes A., Lemos M. P., Correa N., Del Portillo P., Barrera L., Robledo J., Ritacco V., Zambrano M. M. Mutations in DNA repair genes are associated with the Haarlem lineage of Mycobacterium tuberculosis independently of their antibiotic resistance // Tuberculosis (Edinb). - 2007. - T. 87. - № 6. - C. 502-8.
4. Blazquez J. Hypermutation as a factor contributing to the acquisition of antimicrobial resistance // Clin Infect Dis. - 2003. - T. 37 - № 9. - C. 1201-9.
5. Friedberg E. C. DNA damage and repair // Nature. - 2003. - T. 421 - № 6921. - C. 436-40.
6. Cole S. T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S. V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C. E., 3rd, Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M. A., Rajandream M. A., Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J. E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B. G. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. - 1998. - T. 393. - № 6685. - C. 537-44.
7. Lindahl T. New class of enzymes acting on damaged DNA // Nature. - 1976. - T. 259. - № 5538. - C. 64-6.
8. Fromme J. C., Banerjee A., Verdine G. L. DNA glycosylase recognition and catalysis // Curr Opin Struct Biol. - 2004. - T. 14. - № 1. - C. 43-9.
9. Nunoshiba T., deRojas-Walker T., Wishnok J. S., Tannenbaum S. R., Demple B. Activation by nitric oxide of an oxidative-stress response that defends Escherichia coli against activated macrophages // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1993. - T. 90. - № 21. - C. 9993-7.
10. Puri R. V., Singh N., Gupta R. K., Tyagi A. K. Endonuclease IV Is the major apurinic/apyrimidinic endonuclease in Mycobacterium tuberculosis and is important for protection against oxidative damage // PLoS One. - 2013. - T. 8. - № 8. - C. e71535.
11. Tsutakawa S. E., Shin D. S., Mol C. D., Izumi T., Arvai A. S., Mantha A. K., Szczesny B., Ivanov I. N., Hosfield D. J., Maiti B., Pique M. E., Frankel K. A., Hitomi K., Cunningham R. P., Mitra S., Tainer J. A. Conserved structural chemistry for incision activity in structurally non-homologous apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1 and endonuclease IV DNA repair enzymes // J Biol Chem. - 2013. - T. 288. - № 12. - C. 8445-55.
12. Carpenter E. P., Corbett A., Thomson H., Adacha J., Jensen K., Bergeron J., Kasampalidis I., Exley R., Winterbotham M., Tang C., Baldwin G. S., Freemont P. AP endonuclease paralogues with distinct activities in DNA repair and bacterial pathogenesis // EMBO J. - 2007. - T. 26. - № 5. - C. 1363-72.
13. Abeldenov S., Khassenov B. Cloning, expression and purification of recombinant analog of Taq DNA polymerase // Biotechnology. Theory and Practice. - 2014. - № 1. - C. 12-16.
2. Schlosser-Silverman E., Elgrably-Weiss M., Rosenshine I., Kohen R., Altuvia S. Characterization of Escherichia coli DNA lesions generated within J774 macrophages // J Bacteriol. - 2000. - T. 182. - № 18. - C. 5225-30.
3. Olano J., Lopez B., Reyes A., Lemos M. P., Correa N., Del Portillo P., Barrera L., Robledo J., Ritacco V., Zambrano M. M. Mutations in DNA repair genes are associated with the Haarlem lineage of Mycobacterium tuberculosis independently of their antibiotic resistance // Tuberculosis (Edinb). - 2007. - T. 87. - № 6. - C. 502-8.
4. Blazquez J. Hypermutation as a factor contributing to the acquisition of antimicrobial resistance // Clin Infect Dis. - 2003. - T. 37 - № 9. - C. 1201-9.
5. Friedberg E. C. DNA damage and repair // Nature. - 2003. - T. 421 - № 6921. - C. 436-40.
6. Cole S. T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S. V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C. E., 3rd, Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M. A., Rajandream M. A., Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J. E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B. G. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. - 1998. - T. 393. - № 6685. - C. 537-44.
7. Lindahl T. New class of enzymes acting on damaged DNA // Nature. - 1976. - T. 259. - № 5538. - C. 64-6.
8. Fromme J. C., Banerjee A., Verdine G. L. DNA glycosylase recognition and catalysis // Curr Opin Struct Biol. - 2004. - T. 14. - № 1. - C. 43-9.
9. Nunoshiba T., deRojas-Walker T., Wishnok J. S., Tannenbaum S. R., Demple B. Activation by nitric oxide of an oxidative-stress response that defends Escherichia coli against activated macrophages // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1993. - T. 90. - № 21. - C. 9993-7.
10. Puri R. V., Singh N., Gupta R. K., Tyagi A. K. Endonuclease IV Is the major apurinic/apyrimidinic endonuclease in Mycobacterium tuberculosis and is important for protection against oxidative damage // PLoS One. - 2013. - T. 8. - № 8. - C. e71535.
11. Tsutakawa S. E., Shin D. S., Mol C. D., Izumi T., Arvai A. S., Mantha A. K., Szczesny B., Ivanov I. N., Hosfield D. J., Maiti B., Pique M. E., Frankel K. A., Hitomi K., Cunningham R. P., Mitra S., Tainer J. A. Conserved structural chemistry for incision activity in structurally non-homologous apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1 and endonuclease IV DNA repair enzymes // J Biol Chem. - 2013. - T. 288. - № 12. - C. 8445-55.
12. Carpenter E. P., Corbett A., Thomson H., Adacha J., Jensen K., Bergeron J., Kasampalidis I., Exley R., Winterbotham M., Tang C., Baldwin G. S., Freemont P. AP endonuclease paralogues with distinct activities in DNA repair and bacterial pathogenesis // EMBO J. - 2007. - T. 26. - № 5. - C. 1363-72.
13. Abeldenov S., Khassenov B. Cloning, expression and purification of recombinant analog of Taq DNA polymerase // Biotechnology. Theory and Practice. - 2014. - № 1. - C. 12-16.
Загрузки
Выпуск
Раздел
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
