Новый быстрый метод определения молибден ксантиноксидазы молока животных

Анотація

Изучение нитратредуктазной (НаР) и нитритредуктазной (НиР) активностей молибден содержащего фермента, ксантиноксидазы (КО) показало, что в козьем, верблюжьем и кобыльем  молоке КО находится в безмолибденовой и неактивной форме. Нами предложен метод активирования  КО молока экзогенным молибденом и тиолами при термообработке молока при 85^оС в течение 10 минут. Атомы Mo связываются с сульфгидрильными (-SH) группами молибденового кофактора в активном центре КО. Однако при термоденатурации фермента прогреванием эти  SH-группы окисляются кислородом. Поэтому, во время термообработки молока использовались различные антиоксиданты для защиты SH-групп кофактора. НаР и НиР активности КО определяется только количеством нитрита: (1) для НаР, нитрит является продуктом каталитической реакции, и (2) для НиР, нитрит является субстратом.  Для определения количества нитрита используются сульфаниламид и N-(1-нафтил)-этилендиамин. Нами было обнаружено, что в присутствии фосфата, антиоксидантов, дитиотрейтола, аскорбата и дитионита экзогенный молибдат окрашивался сульфаниламидом в синий цвет (максимум поглощения 695 нм). При использовании цистеина или глутатиона в качестве антиоксидантов, молибдат не окрашивался сульфаниламидом, т.е. они не мешали определению нитрита. Используя дитиотрейтол, фосфат и сульфаниламид  установлено включение экзогенного молибдата в молекулу КО мицелл жировых глобул сливки.