ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПОДЛИННОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ ГРИППА МЕТОДОМ ПЦР - ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВСТАВОК, КОДИРУЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ BRUCELLA SPP.
DOI:
https://doi.org/10.26577/bb1083202614Ключевые слова:
ПЦР, рекомбинантные штаммы гриппа, бруцеллезные вставки, валидация, верификацияАннотация
Разработка вирус-векторных вакцин против бруцеллеза требует строгого контроля подлинности рекомбинантных штаммов, используемых в качестве вакцинных кандидатов. Одним из ключевых этапов молекулярной характеристики таких штаммов является подтверждение наличия гетерологичных генетических вставок, кодирующих антигены Brucella. Целью настоящего исследования являлась оценка подлинности рекомбинантных гриппозных штаммов путем определения наличия бруцеллезных генетических вставок методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Объектами исследования служили рекомбинантные штаммы вируса гриппа Flu-NS1-80-Omp16, Flu-NS1-80-L7/L12, Flu-NS1-80-Omp19 и Flu-NS1-80-Cu-Zn SOD, содержащие гены иммунодоминантных белков Brucella. Оценка аналитической чувствительности проводилась с использованием серийных десятикратных разведений положительного контроля с известной концентрацией РНК. Специфичность метода подтверждена наличием ампликонов строго ожидаемого размера (~1250–1300 п.о. для рекомбинантных конструкций и ~890 п.о. для контрольного вируса) и отсутствием неспецифической амплификации в отрицательных контролях. В ходе анализа рекомбинантных штаммов (Flu-NS1-80-OMP16, Flu-NS1-80-OMP19, Flu-NS1-80-SOD, Flu-NS1-80-L7/L12) во всех образцах выявлены целевые фрагменты, что свидетельствует об успешной интеграции вставок Brucella spp. в геном вируса. Оценка воспроизводимости показала 100% совпадение результатов в 10 независимых повторностях для всех исследуемых образцов. Чувствительность метода составила 100%, положительные и отрицательные контроли продемонстрировали ожидаемые результаты, что подтверждает корректность постановки реакции и отсутствие контаминации. Полученные результаты подтверждают подлинность рекомбинантных гриппозных штаммов и наличие в их геноме бруцеллезных генетических вставок, что свидетельствует о корректности конструкции вирусных векторов и возможности их дальнейшего использования при разработке вакцинных препаратов против бруцеллеза.
