ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРИМОГО РЕКОМБИНАНТНОГО AG85B MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS С ПОМОЩЬЮ ЭНДОГЕННОГО ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ N-КОНЦЕВОГО ТИОРЕДОКСИНА В E. COLI
DOI:
https://doi.org/10.26577/bb108320266Ключевые слова:
Mycobacterium tuberculosis, Ag85B, растворимый белок, Escherichia coli SHuffle T7, тиоредоксин (Trx), внутриклеточный протеолиз, экспрессия белкаАннотация
Получение рекомбинантного антигена 85B (Ag85B) Mycobacterium tuberculosis в Escherichia coli ограничивается низкой растворимостью белка и его преимущественным накоплением в виде телец включения. Использование тиоредоксина (Trx) в качестве N-концевого партнёра позволяет повысить растворимость рекомбинантного белка, однако последующее удаление Trx с помощью коммерческих протеаз требует дополнительной стадии обработки и усложняет процесс получения целевого продукта. В настоящей работе предложен подход, основанный на оптимизации условий культивирования E. coli, способствующих как накоплению растворимого Ag85B, так и внутриклеточному удалению N-концевого Trx. Рекомбинантную конструкцию Trx-Ag85B-FLAG-His₆ экспрессировали в клетках E. coli SHuffle T7 и оценивали влияние состава среды, концентрации индуктора, плотности культуры при индукции, температуры и продолжительности культивирования. В исходных условиях LB-среды рекомбинантный белок преимущественно накапливался в нерастворимой фракции в виде полноразмерного продукта массой около 51 кДа, что соответствовало сохранению Trx в составе слитного белка. Использование SB-среды, 0,1 мМ ИПТГ, индукции при OD₆₀₀ 0,8–1,0 и культивирования при 16 °C существенно увеличивало долю растворимого продукта. После длительной инкубации формировался FLAG-положительный продукт с молекулярной массой менее 35 кДа, соответствующий Ag85B без N-концевого Trx и с сохранением C-концевой области FLAG-His₆. Добавление β-меркаптоэтанола в культуральную среду не оказывало существенного влияния на накопление растворимого белка. Полученные результаты согласуются с моделью, согласно которой умеренная кинетика экспрессии способствует формированию растворимого Ag85B, после чего происходит его эндогенная внутриклеточная протеолитическая переработка. Предложенный подход может упростить получение рекомбинантного Ag85B белка за счёт снижения необходимости в отдельной стадии удаления Trx экзогенной протеазой.
